Die Löfflers Methylenblau-Lösung wird zur Färbung von Pilzen, Bakterien und Blutparasiten im Blutausstrich eingesetzt.
Sie kann beispielsweise beim TBC-Nachweis (der Ziehl-Neelsen-Färbung) beitragen, der in Kombination mit der Karbol-Fuchsin-Lösung durchgeführt wird.
Außerdem wird die Methylenblaulösung oftmals zur selektiven Anfärbung von Zellkernen bei der Zählung eukaryontischer Zellen eingesetzt.